豬白細(xì)胞介素4(IL-4)定量分析酶

聯(lián)免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測豬血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-4濃度。使用前請仔細(xì)閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產(chǎn)品包裝破損或質(zhì)量投訴，請?jiān)谑盏截浺粋€(gè)月之內(nèi)聯(lián)系我們。

豬IL-4簡介：

介素4(IL-4)是一種多功能細(xì)胞因子，主要是由激活的T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。IL-4因?yàn)樘腔牟煌?，分子量?/font>15到19kDa不等。豬白介素4的蛋白合成時(shí)有24個(gè)氨基酸的信號肽。成熟的豬白介素4與牛，人，小鼠和大鼠分別有78%，59%，41%和41%的同源性。

IL-4可以對多種細(xì)胞起到調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)功能的作用。白細(xì)胞介素4參與多種B-細(xì)胞等此類細(xì)胞的激活過程，是DNA合成的協(xié)同刺激分子，它能誘導(dǎo)靜息B細(xì)胞上II 型MHC (主要組織相容復(fù)合體)分子的表達(dá)。能增強(qiáng)IgE與 IgG1的分泌以及在細(xì)胞表面的表達(dá)，還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞上對IgE低親和Fc受體的表達(dá)。IL-4在抗體亞型轉(zhuǎn)換中也起到重要的調(diào)節(jié)作用，是T輔助前體細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，從而間接調(diào)節(jié)體液免疫以及抗體的生成。此外，白細(xì)胞介素4基因在機(jī)體中的的遺傳變異可導(dǎo)致缺血性中風(fēng)易感性提高，腦血管意外或腦梗塞等疾病。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-4的濃度。IL-4捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)本或參考品時(shí)，其中的IL-4會與捕獲抗體結(jié)合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當(dāng)加入生物素化的抗豬IL-4抗體后，抗豬IL-4抗體與IL-4接合，形成夾心的免疫復(fù)合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素與親合素特異性結(jié)合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IL-4將會形成免疫復(fù)合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測，讀其450nm處的OD值，IL-4濃度與OD450值之間呈正比，通過參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標(biāo)本中IL-4濃度。

豬IL-4定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒組成:

標(biāo)本收集:

1.標(biāo)本的收集請按下列流程進(jìn)行操作；

A.細(xì)胞上清標(biāo)本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標(biāo)本應(yīng)是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標(biāo)本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測樣本不能及時(shí)檢測，標(biāo)本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復(fù)凍融。

2.血清標(biāo)本不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標(biāo)本應(yīng)清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標(biāo)本檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。

注：豬血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項(xiàng):

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結(jié)晶，請水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。

3.標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時(shí)，請及時(shí)更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴(yán)禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的準(zhǔn)確性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25-28℃。

9.洗滌過程是至關(guān)重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。

10.試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測時(shí)建議作雙復(fù)孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產(chǎn)生。

12.血清和血漿標(biāo)本的檢測時(shí)，檢測抗體的孵育時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長

檢測前準(zhǔn)備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應(yīng)置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時(shí)于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5x標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋。

4.標(biāo)準(zhǔn)品: 按標(biāo)簽復(fù)溶體積加入1X標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液使IL-4終濃度達(dá)到10000pg/ml，室溫反應(yīng)，請嚴(yán)格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混勻（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標(biāo)準(zhǔn)曲線取七個(gè)點(diǎn)，最高濃度為10000 pg/ml,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機(jī)或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實(shí)驗(yàn)過程需自備的材料：

1.不規(guī)格的加樣槍及相應(yīng)的槍頭；   

2.酶標(biāo)儀；

3.自動洗板機(jī)；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計(jì)算并確定一次性實(shí)驗(yàn)所需的板條數(shù)，取出所需板條放置在框架內(nèi)，暫時(shí)用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔,設(shè)置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實(shí)驗(yàn)均需做標(biāo)準(zhǔn)品對照并畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。對于血清血漿樣本，先加50ul的樣本分析緩沖液，再加50uL樣本。如檢測超出范圍，請先加50ul的樣本分析緩沖液，再加入用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后的樣本50μl檢測。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)，此處加樣量50ul相當(dāng)于已稀釋了2倍。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。   

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結(jié)果判斷:

1.復(fù)孔的值在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔的值平均后可作為測量值。

2.每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)本的OD值應(yīng)減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

典型數(shù)值和參考曲線